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2 × Universal Blue Sybr Green Vert QPCR Master Mélanger avec tampon de dilution de 40 × jaune

  • G3326-01

Description du produit

Présentation du produit:

Ce produit est une solution de prémélange 2x pour QPCR à l'aide de la méthode de fluorescence de Sybr Green I Chimérique. Le composant central, la polymérase TAQ ADN, est une ADN activée par la chaleur polymérase bloquée par la méthode d'anticorps, qui peut inhiber efficacement l'amplification non spécifique dans des conditions de basse température. Pendant ce temps, combiné au tampon de réaction optimisé pour QPCR, la polymérase TAQ ADN est très appropriée pour la spécificité élevée et la sensibilité de la réaction QPCR. Une bonne courbe standard peut être obtenue dans une zone quantitative large, précise, reproductible et fiable pour l'analyse quantitative des gènes cible. Dans le même temps, ce produit contient un colorant de référence passif spécial ROX qui convient à l'utilisation dans tous les instruments QPCR, et il n'est pas nécessaire d'ajuster la concentration en ROX sur différents instruments. Le colorant bleu est ajouté dans le prémélange, qui a l'effet traceur de l'ajout d'échantillons et un diluant de gabarits jaune est fourni en même temps. Lorsque le gabarit est dilué avec du diluant de gabarits jaune et ajouté dans le prémélange de réaction bleu, la couleur change de bleu au vert, qui peut jouer un rôle de traceur dans la préparation du processus de système de réaction et prévenir les fuites ou la désaddition. Les spectres des colorants bleu et jaune ne se chevauchent pas avec les colorants QPCR et n'ont aucune incidence sur les résultats de la réaction.

Contenu du colis:

Chat. Non.

Description du produit

Le volume

G3326-1

2x Universal Blue Sybr Green Vert QPCR Master Mix

1ml / 5x1ml / 15x1ml

G3326-2

Tampon de dilution de modèle jaune 40x

1ml

Condition de stockage:

Transport de sac de glace humide; Stocké à -20 température, valable 12 mois.

Usage:

1. (facultatif) Dilution de modèle

Ce kit fournit un tampon de dilution de modèle jaune 40x, une dilution de gabarits jaune diluée de 40 fois pouvant être utilisée pour déterminer avec précision si le gabarit a été ajouté au fluide de réaction QPCR en modifiant la couleur du liquide. Prenant le système de réaction du QPCR 20UL à titre d'exemple, selon la quantité de gabarit de dilution ajoutée dans la solution de réaction du QPCR 20UL, le procédé de dilution correspondant du gabarit d'origine peut être référé sur le tableau suivant (en prenant le gabarit d'origine dilué à 100UL à titre d'exemple. ):

Ajoutez le gabarit dilué à la solution de réaction de 20UL QPCR (UL)

1

2

3

4

5

6

7

8

Ajouter le tampon de dilution de modèle jaune 40x à laSystème de dilution de modèle 100UL(ul)

50

25

16.7

12.5

10

8.4

7.2

6.3

Ajouter le système de dilution de gabarit 100UL au modèle principal (UL)

x

x

x

x

x

x

x

x

Volume d'ajout de nucléase - eau libre (ul)

50-x

75-x

83.3-x

87.5-x

90-x

91.6-x

92.8-x

93,7-x

Exemple: Un modèle dilué 2UL doit être ajouté au système de réaction du QPCR 20UL. Prenant le système de dilution de gabarits 100UL à titre d'exemple, lorsque le volume de gabarit d'origine est 20UL, le tampon de dilution de modèle jaune 25UL 40X est ajouté, puis une eau sans nucléase 55UL est ajoutée au volume total de 100UL. Le tampon de dilution de modèle jaune 40X est maintenant de 10x. Ajoutez 2UL du modèle dilué dans une tampon de dilution de dilution de 20UL et le tampon de dilution de la gabarit jaune de la finale 40 × est 1x. En conclusion, le tampon de dilution de modèle jaune doit être 1x dans le système Final QPCR.

Remarque: Si le modèle n'a pas besoin d'être dilué, ou si le diluant de gabarit de G3362-2 n'est pas utilisé, vous pouvez ignorer cette étape.

2. Recommander le système de réaction QPCR:

Composant

20UL RXN

50UL RXN

Concentration finale

2 × Universal Blue Sybr Green Vert QPCR Master Mix Mix

10UL

25UL

1 ×

Apprêt avant (10euh) un

0.4UL

1l

0.2um

Apprêt inversé (10um) a

0.4UL

1l

0.2um

Templateb

Variable

Variable

comme demandé

Eau sans nucléase

Ajouter à 20ul

Ajouter à 50ul


une. Habituellement, un bon effet d'amplification peut être obtenu avec la concentration finale de 0,2um. Lorsque la performance de la réaction est médiocre, la concentration d'amorce peut être ajustée dans la plage de 0,2-1.0um.

b. La quantité d'addition de modèles varie avec le numéro de copie du gène cible dans la solution de modèle et la quantité appropriée de l'addition de modèles est décrite par dilution de gradient. La meilleure quantité d'addition d'ADN de modèle dans le système de réaction 20UL était inférieure à 100 ng. Lorsque l'ADNc (solution réactionnelle RT) de la réaction RT-PCR a été utilisée comme modèle, la quantité d'addition ne doit pas dépasser 10% du volume total de la solution de réaction PCR.

3. Procédure de réaction PCR (peut être ajustée en fonction des instruments):

UNE.Méthode de deux étapes

B. Méthode de trois étapes

Étape

Étape

Numéro de cycle

Température

Time

Étape

Étape

Numéro de cycle

Température

Time

Étape 1

Prégrégation

1

95

30 secondes

Étape 1

Prégrégation

1

95

30 secondes

Étape 2

Dégénérescence

40

95

15 secondes

Étape 2

Dégénérescence

40

95

15 secondes

Extension de recuit

60

30seconde

recuation

55-65

10 secondes




extension

72

30 sec

Étape 3

courbe de fusion

1

Paramètres par défaut de l'instrument

Étape 3

courbe de fusion

1

Paramètres par défaut de l'instrument

R: Si la spécificité d'amplification doit être améliorée, une procédure en deux étapes ou une température de recuit peut être utilisée; Pour améliorer l'efficacité de l'amplification, une procédure en trois étapes ou une durée d'extension peut être utilisée.

Remarques:

1. Si le tracage de pipettage n'est pas requis, n'utilisez pas de tampon de dilution de modèle jaune 40x pour la dilution de gabarit.

2. Avant d'utiliser le réactif, veuillez le mélanger doucement et descendre doucement, ne tourez pas et oscillez pour éviter les bulles.

3. Lors de la préparation de la solution réactionnelle, mettez le réactif sur la glace.

4. Ce produit contient une coloration fluorescente Sybr Green et une lumière forte doit être évitée lors de la préparation de la solution de réaction PCR.

5. Veuillez utiliser une nouvelle pointe de pipette jetable pour la préparation et le reconditionnement du liquide de réaction pour éviter la contamination croisée entre les échantillons autant que possible.

6. Évitez de répéter le mélange maître de gel-dégel, essayez de l'utiliser dans un délai d'un mois après la décongélation.

Compatibilité:

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT FAST, STEPONE ™, Stepone Plus ™, 7500/7500 Fast, VIIA 7 ™, Quantiia ™ Series, PikorealTM Cycler;

Stratagene: MX3000P®, 3005P ™, 4000 ™;

BIO-RAD: CFX96 ™, CFX384 ™, ICLCER IQ ™, IQ5 ™, MyIQ ™, Miniopticon ™, Opticon®, Opticon 2, ChromO4 ™;

EPPENDORF: Realplex 2s, MasterCycler® EP, Realplex;

IIIUMINA: ECO QPCR;

Céphée: SmartCycler®;

QIAGEN CORBETT: série Rotor-Gene®;

Roche: Série LightCycler ™;

TAKARA: Série de dés Cycler thermique;

Analytikjena: série QTower;

QTower: Série Linegene.

Principes de conception d'apprêt:

1. La longueur du produit d'amplification est recommandée entre 80 et 300 pb;

2. Longueur d'amorçage: 18-25 pb;

3. Le contenu de la base G + C dans les amorces doit être compris entre 40% et 60%;

4. La différence de valeur TM entre les amorces avant et les amorces inverses est inférieure à 2 et la valeur TM entre 58-62 ° C est la meilleure;

5. aléatoire de la distribution de base;

6. Les amorces avaient mieux de ne pas contenir de séquences auto-complémentaires, sinon elles formeront une structure de coiffure secondaire;

7. Il ne devrait y avoir plus de 4 bases complémentaires ou homologues entre deux amorces, sinon la dimère d'amorce sera formée, en particulier des chevauchements complémentaires à l'extrémité 3 ';

8. Le terminal de 3 'de l'amorce est suggéré d'être g ou c;

9. Aucun autre produit non spécifique n'a été trouvé dans les résultats de comparaison de la NCBI.

Problèmes courants et solutions:

Description du problème

Raisons possibles

Solutions

À la fin de la réaction, aucune courbe d'amplification n'est apparue ou une valeur CT n'est apparue trop tardive

La concentration de modèle est trop faible

Répétez l'expérience pour réduire la dilution de modèle multiple et commencer à partir de la concentration la plus élevée lorsque la concentration de l'échantillon est inconnue.

Dégradation du modèle

Le modèle a été préparé à nouveau et l'expérience a été répétée


Il y a des inhibiteurs de PCR dans le système

Généralement, le gabarit est effectué, le rapport de dilution du gabarit est augmenté ou le gabarit avec une pureté élevée est réparé et répété


Les amorces peuvent se dégrader

Les amorces qui n'ont pas été utilisées pendant une longue période doivent d'abord être testées pour l'intégrité par électrophorèse de page pour exclure la possibilité de dégradation


Efficacité faible amplification

Numérez la concentration d'amorce, essayez une procédure d'amplification en trois étapes ou de redéfinir l'amorce


Le produit d'amplification est trop long

La longueur du produit d'amplification a été contrôlée dans la plage de 80-300 pb


La commande vierge montre le signal

Pollution du système de réaction

Premièrement, l'eau de contrôle vierge doit être remplacée. Si la même situation survient toujours, les amorces, les aspirateurs et les tubes PCR doivent être remplacés ou un nouveau mélange maître devrait être démarré. Le système de réaction est préparé dans une table super propre pour réduire la pollution de l'aérosol

L'amplification non spécifique telle que les dimères d'amorce apparaissent

Généralement, il est normal que les produits d'amplification apparaissent sous contrôle vierge après 35 cycles, qui doivent être analysés avec la courbe de fusion.

Refonte Primer, ajustez la concentration d'amorce ou optimisez la procédure de réaction PCR


La courbe de fusion a plusieurs pics

La conception d'amorce est mauvaise

La nouvelle amorce a été ré-conçue selon les principes de conception de l'amorce

La concentration d'amorce est trop élevée

Réduire la concentration d'amorce de manière appropriée


Il y a une contamination génomique dans le modèle d'ADNc

La solution d'ARN extraite est digérée à l'aide d'enzymes d'ADN, telles que DSDNase, pour éliminer la contamination génomique ou pour concevoir des amorces de transintrontrons


Mauvaise reproductibilité des expériences

L'erreur d'ajout d'échantillon est grande

L'utilisation d'une pipette précise, avec une pipette précise de la tête d'aspiration de haute qualité;

Modèle de dilution élevé, ajout d'un modèle de volume important pour réduire l'erreur d'échantillonnage;

Le volume de réaction de QPCR a été agrandi

La concentration de modèle est trop faible

Répétez l'expérience pour réduire les temps de dilution du modèle


Déviation de température à différents endroits de l'instrument QPCR

Calibrer régulièrement l'instrument QPCR


La courbe d'amplification n'est pas lisse

Le signal de fluorescence est trop faible, produit après la correction du système

Assurez-vous que les colorants prémélangés dans le mélange maître ne sont pas dégradés;

Remplacer le signal fluorescent pour collecter de meilleurs consommables QPCR

Courbe d'amplification Breaks ou Slips

La concentration de gabarit était plus élevée et la valeur du point d'extrémité de base était supérieure à la valeur CT

Le point final de base (la valeur CT -3) a été réduit et les données étaient réanalysées

Les courbes d'amplification des puits individuels ont soudainement chuté brusquement

Il y a des bulles dans le tube de réaction

Assurez-vous que le mélange est complètement dissous et ne tourne pas et oscille uniformément;

Une fois l'échantillon ajouté, les bulles sont éliminées par centrifugation avec une lumière élastique.

Le temps de pré-dénaturation a été étendu à 10 minutes pour éliminer les bulles

G3326-01ASlice 11Slice 13Slice 10Slice 12télécharger


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