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ADN LIGASE 2 × in-Fusion CLONING CLONING MIX BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Réactif

Spécification: 100t
  • G3350-100T
  • Servicebio
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Description du produit

G3350-100T

Introduction:

2 × Le mélange de clonage dans la fusion peut rapidement liguer et cloner single ou 2 ~ 3 fragments multiples dans le vecteur. Il convient particulièrement à une ligature à fragment unique et l'efficacité de la ligature de fragments de 2-3 sera réduite. Utilisez n'importe quelle méthode pour linéariser le vecteur et introduisez la séquence d'extrémité du vecteur linéarisé à 5'end de l'amorce d'amplification avant / arrière du fragment d'ADN inséré dans le vecteur linéarisé, de sorte que les 5'And 3'end de la Les produits d'amplification PCR sont respectivement une séquence (15-25 BP) compatible avec la fin du vecteur linéarisé. Dans le prémélange de mélange de clonage de clonage 2 × in-Fusion, mélanger le produit PCR avec la même séquence aux deux extrémités du vecteur linéarisé et le vecteur linéarisé dans une certaine proportion, puis incuber sur la glace (ou dans un mélange de glace et d'eau) Pendant 5 minutes, vous pouvez transformer des cellules compétentes et compléter le clonage directionnel.

Ce prémélange peut atteindre un clonage sans soudure d'ADN rapide et rapide. Et peut être utilisé pour la construction de plasmides recombinants ou de plasmides recombinants de mutation de gènes. Le prémélange ne dépend pas du système LIGASE, ce qui réduit considérablement le fond de l'auto-ligature de vecteur et, en même temps, il n'a pas besoin d'envisager les sites d'endonucléase de restriction contenus dans l'insert lui-même. Pour la construction de plasmides recombinants d'ADN à seconde segment, la proportion de clones positifs obtenus en utilisant ce prémélange est aussi élevé que 99%. L'utilisation de ce prémélange ne s'appuie pas sur un équipement de température constante et toutes les opérations de la préparation de l'échantillon d'ADN à la transformation et à la placage de produits recombinants peuvent être complétées dans quelques heures, ce qui permet de gagner du temps.

Stockage et transport

Transport avec glace humide; Stockage à -20 ° C, valable 12 mois.

Composant

G3350-10T

G3350-20T

G3350-100T

2 × mélange de clonage in-fusion

50 μl

100 μL

5 × 100 μl

PUC19 (linéarisé, vecteur de contrôle, 5 ng / μl)

-

10 μL

10 μL

Insert de contrôle (10 ng / μl)

-

10 μL

10 μL

Manuel de l'Utilisateur

1

Système de réaction (système de réaction de 10 μL recommandé)

Composant

Le volume

2 × mélange de clonage in-fusion

5 μL

Vecteur

X μl

Segment d'ADN

Y μL

Eau sans nucléase

Ajouter à 10 μL

Conditions de réaction

Bain d'eau glacée (mélange d'eau glacée), réagit pendant 5-10 min.


Conversion de produit de réaction

1. Retirez les cellules compétentes (telles que E.Coli DH5α, E.Coli TOP10, etc.) du réfrigérateur à -80 ° C et les dégelez sur la glace.

2. Ajoutez l'échantillon réagi à l'état compétent, déplacez doucement le fond du tube avec vos doigts pour mélanger et baigner dans la glace pendant 30 minutes.

3. Le produit est ensuite placé dans un bain d'eau de 42 ° C pour chauffer pendant 90 secondes. Après l'achèvement, il est rapidement placé sur la glace et baigné de glace pendant 2 à 5 minutes.

4. Prenez 900 μl de support soc ou lb stérile et ajoutez-le au tube EP. Après mélange, placez le tube EP sur un agitateur et incubez à 220 tr / min à 37 ° C pendant 1 heure pour récupérer les bactéries (il peut également être placé dans un incubateur de 37 ° C pour une culture de lieu statique pendant 1 heure);

5. Selon les exigences expérimentales, dessinez différents volumes de cellules compétentes transformées et ajoutez-les au milieu solide LB contenant les antibiotiques correspondants, étalez les cellules uniformément et, après que le liquide est complètement absorbé, placez la plaque à l'envers dans un 37 ° C. incubateur et cultivez la nuit.

Identification des clones positifs

Les colonies monoclonales cultivées sur la plaque sont cueillies pour l'identification de la PCR de colonie ou après la culture, le plasmide est extraite par la digestion de restriction ou l'identification de la PCR, ou le plasmide extrait est directement séquencé et analysé pour l'identification.

Précautions

1. Le fragment vectoriel et cible doit être purifié par gel et électrophorèse pour détecter leur qualité et leur concentration. Lorsque la concentration est faible, il n'est pas nécessaire d'ajouter de l'eau et de l'utiliser directement pour compenser.

2. La valeur TM entre les régions chevauchantes de plusieurs fragments doit être cohérente et> 60 ° C.

3. Il est recommandé que le rapport molaire de vecteur à insertion est 1: 1 ~ 1: 3; Lorsque 2-3 fragments sont connectés, le rapport molaire entre chaque fragment est de 1: 1 et l'efficacité de la ligature de 2-3 fragments sera réduite. Le système de réaction de la ligature peut être augmenté dans des proportions égales. .

4. Lorsque le volume total du vecteur et de l'insert est supérieur à 5 μL, le système de réaction peut être amplifié à 20 μL.

5. Le volume du produit de la ligature ne doit pas dépasser 1/10 du volume de la cellule compétente, sinon l'efficacité de la transformation sera considérablement réduite. Le volume du produit de ligature et la cellule compétente peuvent être augmentés dans la même proportion (par exemple 20 μL du système de ligature pour transformer 200 μl de cellules compétentes).

6. 2 × Le mélange de clonage en fusion est recommandé pour être utilisé lorsqu'il est utilisé et retourné à -20 ° C immédiatement après utilisation. Après décongélation, il peut être divisé en paquets et congelés pour réduire les temps de congélation répétés et de décongélation.

7. Lorsque l'électroporation est utilisée pour la transformation, le produit de la réaction doit être purifié par méthode de colonne ou méthode de précipitation à l'éthanol.

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