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Click-IT Kit de détection de prolifération cellulaire EDU-647

Volume: 100t

  • G1604
  • Servicebio

Description du produit

Présentation du produit:

C'est une méthode d'évaluation courante et importante dans les sciences de la vie pour déterminer l'influence de certains gènes, drogues, etc. sur les cellules cultivées in vitro en analysant la capacité de prolifération cellulaire ou en analysant la croissance et la capacité de renouvellement des cellules tissulaires individuelles sous différents conditions ou interventions de stimulation. . Il existe de nombreuses méthodes pour détecter la prolifération cellulaire. La plupart d'entre eux utilisent des enzymes métaboliques produites par des cellules pour évaluer indirectement l'activité de prolifération des cellules (telles que la méthode CCK-8, la méthode MTT, etc.), mais certains médicaments ou facteurs tels que l'état de la cellule elle-même auront un certain impact sur les résultats de l'évaluation. La détection directe de la synthèse de l'ADN dans les cellules pour déterminer la prolifération cellulaire est reconnue comme la méthode de détection la plus précise et la plus efficace. Toutefois, la méthode d'incorporation de nucléoside radiomarquée d'origine et l'amélioration ultérieure de la méthode BRDU basée sur la détection d'anticorps ont leurs propres limitations.

EDU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine, 5-éthynyl-2'-désoxyuridine) est un analogue de thymidine contenant un groupe d'acétylène, lorsqu'il est injecté dans des animaux ou des cellules d'incubation cultivées in vitro, ces petites molécules peuvent rapidement diffuser à divers organes et Les tissus et s'infiltrent dans les cellules et peuvent remplacer la thymidine (T) dans un ADN nouvellement synthétisé pendant la prolifération cellulaire. Le groupe d'acétylène dans la molécule EDU peut réagir avec la sonde composée azide marquée fluorescente pour former une bague de triazole stable sous la catalyse des ions de cuivre, de sorte que l'ADN nouvellement synthétisé peut être étiqueté avec la sonde fluorescente correspondante. Comparé à la méthode de constitution de nucléoside radiomarquée, la méthode de détection EDU n'a aucun facteur limitant tel que la contamination radioactive; Comparé à la méthode de détection BRDU, la méthode de détection EDU ne nécessite pas de traitement de dénaturation de l'ADN ou de réaction d'anticorps antigène, qui réduit considérablement la complexité de l'expérience et du temps, il devient également plus d'économie de temps, plus sensible, plus stable et plus précise . Ce kit peut être utilisé pour détecter la prolifération cellulaire dans les cellules cultivées ou les tissus animaux in vitro. La sonde fluorescente dans ce kit est la fluorescence rose (infrarouge lointaine), la longueur d'onde d'excitation maximale est de 656 nm et la longueur d'onde d'émission maximale est de 670 nm. Une fois que les cellules proliférantes sont étiquetées, le noyau cellulaire montrera une fluorescence rose vif. Colorants Co-étiquette Nuclei (HoechstSt 33342 Nucleus cellulaire est fourni dans ce kit). Les microscopes de fluorescence, les microscopes confocaux laser et d'autres instruments peuvent être utilisés pour observer directement la prolifération cellulaire; La cytométrie de flux peut également être utilisée pour détecter l'intensité de la fluorescence des cellules cultivées in vitro. Déterminer l'activité de réplication de l'ADN dans la phase S du cycle de cellule.

Stockage et transport

Transporté dans la glace humide; stocké à -20 ° C dans le réactif catalytique sombre et éduqué (réactif a) et tampon de réaction peut être stocké à 4 ° C; Valable pendant 12 mois.

Remarques: Les temps de réaction ci-dessus correspondent à une détection de la plaque de 96 puits.

Préparation expérimentale

1. Moyen de culture cellulaire contenant du sérum;

2. Solution de perméabilisation: solution tampon contenant 0,2 à 0,5% de triton X-100 (G1204 est recommandée);

3. Solution de fixation: 4% paraformaldéhyde (G1101 recommandé) ou d'autres réactifs à des fins similaires;

4. Tampon PBS (G4202 est recommandé);

5. Eau ultra-pure;

6. Réactifs liés à la modélisation des animaux et à la section des tissus (détection de la prolifération des cellules des tissus animaux).

Étapes d'opération:

1. Préparation d'échantillons de cellules et de réactifs in vitro:

1.1. Plantez les cellules uniformément dans la plaque de culture cellulaire à une certaine densité (la densité de plantation est déterminée par des facteurs tels que la taille de la cellule, la vitesse de croissance, etc.). Une fois les cellules adhérant au mur ou revenir à un état normal, effectuez une stimulation de médicament correspondante et d'autres traitements (tels que des cellules de suspension testées, veuillez suivre le mode de fonctionnement normal des cellules de suspension, l'expérience complète doit ajouter des étapes telles que la centrifugation).

1.2. Centrifuger l'additif catalytique (réactif C) à basse vitesse, ajoutez 1 ml d'eau de ultrapure pour la dissoudre et stockez-le à -20 pour une utilisation ultérieure.

2. Étiquetage EDU, fixation et perméabilisation des cellules in vitro:

2.1. Préparer 2 × Solution de travail d'incubation EDU: Ajoutez une solution de stockage EDU à 2 μL (10 mm) sur 1 ml de milieu de culture cellulaire complète, qui est une solution de travail d'incubation de 20 μm 2 × EDU, et le mettre dans l'incubateur pour préchauffer (il est recommandé que l'expérience pré-expérimente soit explorée avec une concentration de 10 μm de travail EDU);

2.2. Dans le mode de milieu à moitié changeant, aspirez la moitié du milieu de culture cellulaire d'origine dans la plaque de culture et ajoutez un volume égal de solution de travail d'incubation de 2 × EDU préchauffée et incube pendant une certaine période (le temps d'incubation dépend généralement de sur la croissance des cellules correspondantes Le cycle représente généralement environ 10% du temps de cycle de la cellule. Pour la plupart des cellules adhérentes et la plus en croissance rapide, il est recommandé d'incuber pendant environ 2 heures. Pour des conditions spécifiques, il doit être ajusté en fonction de la caractéristiques des cellules et conditions réelles après traitement. Si une incubation plus longue est requise, le temps peut réduire de manière appropriée la concentration de fonctionnement de l'EDU; pendant une période plus courte, la concentration EDU peut être accrue de manière appropriée);

2.3. Une fois que l'échantillon de cellules étiquetées EDU est lavé avec du tampon PBS pendant 1 à 2 fois, ajoutez la solution fixative pour recouvrir les cellules et fixez-la à la température ambiante pendant 15 minutes (si la détection de flux est requise, adhérer aux cellules avant cette étape après digestion et remise en suspension, corrigez-le, puis suivez la méthode de traitement des cellules de suspension); Laver 2-3 fois avec le tampon PBS, à chaque fois pendant 3-5 min;

2.4. Retirez le tampon PBS, ajoutez de la perméat pour couvrir les cellules ou les tissus et incuber à la température ambiante pendant 15 minutes;

2.5 Après avoir retiré le perméat, lavez 1-2 fois avec le tampon PBS pendant 3 à 5 minutes à chaque fois, puis passez à l'étape 4.

3. Traitement de la modélisation d'injection et du tissu d'injection d'animaux:

3.1. Selon les exigences expérimentales, une ou plusieurs injections EDU sont utilisées pour modéliser les animaux par injection intrapéritonéale, injection intramusculaire, injection sous-cutanée, injection de veine queue, etc. En règle générale, le rapport de dosage EDU au poids corporel de l'animal est de 5 mg / kg. Injection spécifique Le montant dépend du contenu de la recherche et des conditions animales. Une partie de la solution de stockage EDU est fournie dans ce kit, principalement utilisé pour l'étiquetage in vitro de la cellule EDU. Si vous avez besoin de modéliser les animaux avec EDU, vous pouvez commander séparément de réactif EDU (G5059 est recommandé);

3.2. L'intestin grêle et d'autres cellules tissulaires épithéliales prolifèrent rapidement et les cellules de tissu cérébral se prolifèrent lentement. Les tissus à croissance plus rapide prennent généralement moins de 12 heures à marquer, tandis que le tissu de plus en plus lent peut prendre plusieurs jours pour marquer; Le meilleur délai de marquage repose sur en fonction de l'expérience spécifique, car le petit tissu épithélial intestinal prolifère rapidement, il est recommandé d'utiliser ce type de tissu comme référence d'étiquette;

3.3. Une fois que les animaux modélisés sont mis au décès selon les normes prescrites, les tissus requis sont retirés, et des sections congelées ou des sections de paraffine sont effectuées conformément aux procédures classiques;

une. Pour les sections congelées: retour à la température ambiante, ajoutez une quantité appropriée de fixatif et fixez-la à la température ambiante pendant 15 minutes. Retirez le fixatif et laver 3 fois avec une quantité appropriée de tampon PBS pendant 3 à 5 minutes chacune; Retirez le tampon PBS et recouvrez le tissu avec une quantité appropriée de solution de perméabilisation et incubez à la température ambiante pendant 10-15 min; Retirez la solution de perméabilisation et lavez-la 1 avec du tampon PBS -2 fois, 3-5 min à chaque fois, puis passez à l'étape 4.

b. Pour les sections de paraffine: déparaffiniser et réhydrater les sections et se laver avec du PBS pendant 5 min. Retirez le tampon PBS, ajoutez de la perméat pour couvrir les cellules ou les tissus et incuber à la température ambiante pendant 15 min; Après avoir retiré le perméat, lavez 1-2 fois avec le tampon PBS pendant 3 à 5 minutes à chaque fois, puis passez à l'étape 4.

4. EDU Cliquez sur la réponse:

4.1. Pendant la fixation et la perforation des cellules ou des tissus, préparez la solution de réaction de clic (pour différents systèmes de préparation d'échantillons, reportez-vous au schéma dans le tableau ci-dessous)

Pour les cellules cultivées in vitro: Cette étape de référence correspond au volume et au dosage de 10 échantillons de plaque à 96 puits (100 μL par puits). Le montant de la préparation peut être augmenté ou diminué proportionnellement aux exigences d'utilisation. Veuillez ajouter les composants dans l'ordre indiqué dans le tableau ci-dessous. Ajouter un côté et bien mélanger (préparé et utilisé maintenant);

Composant

Le volume

Tampon de réaction

935 μl

Réactif catalytique (réactif a)

10 μL

Dye fluorescent IF647 (réactif b)

5 μL

Additifs catalytiques (réactif c)

50 μl

Capacité totale

1000 μl

Pour les tranches de cellules tissulaires: reportez-vous au système suivant pour la préparation du système de solution de réaction de clic. Le montant de la préparation peut être augmenté ou réduit proportionnellement au nombre d'échantillons coupés. Chaque échantillon de tranche est recouvert d'environ 100-200 μL de solution de réaction click.

Composant

Le volume

Tampon de réaction

928 μL

Réactif catalytique (réactif a)

10 μL

Dye fluorescent IF647 (réactif b)

12 μL

Additifs catalytiques (réactif c)

50 μl

Capacité totale

1000 μl

4.2. Retirez le tampon PBS de l'étape précédente (étape 2.5 ou 3.3), ajoutez la solution de réaction de clic, secouez doucement pour vous assurer que la solution réactionnelle recouvre toutes les cellules ou toutes les tissus et incubé pendant 30 min à température ambiante dans le noir;

4.3. Retirez la solution de réaction de clic et lavez 2 à 3 fois avec le tampon PBS pendant 3 à 5 minutes à chaque fois (s'il n'y a pas d'autres exigences particulières, vous pouvez utiliser la cytométrie de flux pour détecter l'intensité de la fluorescence ou utiliser d'autres instruments pour détecter l'effet de fluorescence) .

5. Coloration nucléaire:

5.1. Retirez le tampon PBS à l'étape précédente, diluez la solution de coloration HOECHST 33342 et le tampon PBS sur un rapport de 1: 500-1000, ajoutez les cellules de recouvrement et incubez pendant 5 min;

5.2. Retirez la solution de coloration Hoechst 33342 et lavez 2 à 3 fois avec le tampon PBS pendant 3 à 5 minutes à chaque fois.

6. Analyse d'imagerie et de détection

Placez directement les cellules de culture ou des échantillons de tranche de tissu dans un microscope à fluorescence ou un microscope confocal pour analyser la proportion de cellules proliférantes; Ou collecter les cellules cultivées in vitro et utiliser un cytomètre d'écoulement pour détecter l'intensité de la fluorescence (il est recommandé d'utiliser un échantillon de cellules étiqueté EDU est utilisé comme contrôle négatif pour la détection de cytométrie de flux et la tension appropriée est sélectionnée). Selon l'intensité de la fluorescence, l'activité de réplication de l'ADN dans la phase S du cycle cellulaire peut être jugée. Les caractéristiques spectrales correspondantes du colorant fluorescent IF488 (réactif B) dans ce kit sont EX / EM: 491 NM / 516 Nm (vert); Les caractéristiques spectrales correspondantes de la solution de coloration HoechstSt 33342 sont EX / EM: 346 nm / 460 nm (bleu).

G1604

Remarques:

1. Pour les cellules cultivées in vitro, la concentration et le temps d'incubation spécifiques peuvent être ajustés de manière appropriée en fonction de l'échantillon et du but de la recherche.

2. Certaines cellules de tissus prolifèrent lentement. Afin d'éliminer les facteurs tels que des effets de modélisation médiocres, il est recommandé de sélectionner des échantillons de tissus avec une prolifération rapide en tant qu'échantillons de référence (tels que les tissus intestinaux).

3. Si la couleur d'arrière-plan est trop sombre, elle peut être causée par un lavage insuffisant dans l'expérience, un temps de fixation de l'échantillon de tissu trop long et une fixation résiduelle.

4. Réactif d'addition catalytique EDU (réactif c) est facile à oxyder. Essayez d'éviter une exposition prolongée à l'air. Après avoir été préparé dans une solution aqueuse, il est recommandé de stocker dans Aliquot; Après le test, si la couleur de l'édition catalytique EDU change légèrement, le système catalytique de la réaction de clic reste le même qu'il peut procéder normalement. S'il semble brun, cela indique que le composant a expiré, alors s'il vous plaît, jetez-la.

5. Veuillez porter des manteaux de laboratoire et des gants jetables pendant le fonctionnement.

Ce produit est à des fins de recherche scientifique uniquement, pas pour le diagnostic clinique!

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