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Kit de détection BRDU pour détection d'ADN Détection de la prolifération de cellules 100T Réactif de détection

Le volume:100t

  • G4102-100T
  • Servicebio

Description du produit

Information produit

Nom du produit

Chat. Non.

spécification

Kit de détection BRDU

G4102-50T

50t

G4102-100T

100t

Présentation du produit:

Ce produit de détection BRDU est utilisé pour la détection de la prolifération cellulaire des cellules et des sections de tissu. BRDU (5-bromo-2-désoxyuridine), qui est 5-bromodésoxyuridine, est un analogue de thymidine (T). Le principe de ce kit est que BRDU peut remplacer la thymidine T par la concurrence. Entrez la phase de synthèse de l'ADN). Lorsque BRDU est intégré à des cellules de la division vigoureuse, les cellules contenant de la BRDU peuvent être détectées en utilisant l'anticorps anti-BRDU et l'anticorps ligase ou la fluorescéine sous forme de système indicateur, et combinés avec d'autres marqueurs de cellules pour la double étiquetage, la prolifération des cellules peut être jugée. Les types, la vitesse de prolifération, etc. sont d'une grande importance pour l'étude de la dynamique des cellules. BRDU entre dans des cellules tissulaires à travers une injection intravitale ou une culture cellulaire, et l'ADN incorporé en elle est positionné avec précision, ce qui peut refléter efficacement le niveau d'ADN nouvellement synthétisé dans les cellules en phase S et est moins affecté par l'environnement interne et externe de la cellule. et l'étiquette ne sera pas perdue.

Stockage et transport

Sac de glace (glace mouillée); Fluide de rupture, fluide de blocage (3% BSA), 1 m HCl peut être stocké à 4 ° C, 4% paraformaldéhyde peut être stocké à la température ambiante, anti-BRDU (Mouse MAB) doit être stockée à -20 ° C, expiration Date 12 mois.

Composant

Numéro de composant

Composant

G4102-50T

G4102-100T

G4102-1

Liquide de rupture

30 ml

30 ml

G4102-2

Fluide d'étanchéité (3% BSA)

30 ml

30 ml

G4102-3

4% paraformaldéhyde

30 ml

30 ml

G4102-4

1 m hcl

30 ml

30 ml

G4102-5

Anti-BRDU (Mouse MAB)

50 μl

100 μL

Manuel de l'utilisateur du produit

1 pc

1 pc

Préparation expérimentale

1. Apportez votre propre tampon PBS (recommandé G4202), anticorps secondaire, éthanol à gradient, comprimés de montage, etc.

2. Apportez votre propre solution de coloration nucléaire, recommandez la tache de la tache de l'hématoxyline G1004 ou la tache DAPI G1012 (prêt à l'emploi);

3. Préparer une solution de travail anti-BRDU primaire d'anticorps: diluer anti-BRDU (Mouse MAB) avec une solution de blocage (3% BSA) 100 fois pour préparer une solution de travail anti-anticorps anti-BRDU, préparez-le pour une utilisation actuelle, stockez à 4;

4. Solution de travail d'anticorps secondaire: Préparez votre propre étiquette de HRP (Détection de lumière blanche ultérieure, kit de couleur DAB, recommandé G1212) ou étiqueté fluorescente (détection de fluorescence ultérieure) anticorps secondaire anti-souris et diluer avec du PBS pour préparer du liquide de travail d'anticorps secondaire .

Étapes d'opération:

Échantillon de cellule:

1. Préparation des cellules: Préparez les glissières cellulaires à l'avance pour vous assurer que les cellules sont en état normal et respectent bien;

2. Incubation BRDU: Les cellules sont incubées avec un milieu contenant de BrDU dans un incubateur dans l'obscurité pendant une certaine période. La concentration de BRDU et le temps d'incubation des cellules sont différentes selon le type de cellule. Il est recommandé d'explorer les meilleures conditions de pré-expérimenter. Les conditions expérimentales des cellules testées dans les précautions sont à titre de référence;

3. Fixation cellulaire: Les cellules susmentionnées ont été incubées avec BRDU et lavées 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Ajoutez 1 ml de 4% de paraformaldéhyde à l'orifice pour couvrir les cellules et fixer pendant 20 à 30 minutes à la température ambiante. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

4. Perméabilité: Ajoutez du liquide de rupture à l'orifice pour couvrir les cellules pendant 8 à 10 minutes, lavez-la avec du PBS 3 fois, 5 minutes à chaque fois;

5. Coloration nucléaire (facultatif):

Pour la détection de lumière blanche ultérieure, assécher le noyau cellulaire avec hématoxyline: ajoutez une solution de coloration de l'hématoxyline à la plaque de puits pendant 5 min à la température ambiante, aspirez à la solution de coloration de l'hématoxyline et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 min;

Pour la détection ultérieure de la fluorescence, tacher le noyau cellulaire avec DAPI: ajoutez une solution de colorant DAPI à la plaque de puits pendant 5 min à la température ambiante, aspirez à la solution de colorant DAPI et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois;

6. RE-fixation: ajoutez 4% paraformaldéhyde goutte à goutte à la plaque de puits et incuber pendant 10 min à température ambiante, lavez 3 fois avec du PBS, 5 min à chaque fois;

7. Acidification: Ajoutez 1 m HCl goutte à goutte à la plaque de puits pour couvrir les cellules, traiter à 37 ° C pendant 10 min, lavez 3 fois avec du PBS, 5 min à chaque fois;

8. Post-fixation: ajoutez à nouveau 4% de paraformaldéhyde à nouveau goutte à la plaque de puits, incuber à la température ambiante pendant 10 min, lavez-le avec du PBS 3 fois, à 5 minutes à chaque fois;

9. Blocage: Ajouter une solution de blocage (3% BSA) goutte à goutte à la plaque de puits et incuber pendant 30 min à la température ambiante. Absorber et jeter la solution de blocage, ne nettoyez pas;

10. Incubation anticorps anti-BRDU: Ajouter une solution de travail anti-anticorps principale anti-BRDU à goutte à goutte à la plaque de puits pour couvrir les cellules et incuber la nuit à 4 ° C. Aspirez et jetez la solution d'anticorps anti-BRDU primaire, lavez-la avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

11. Incubation d'anticorps secondaire: déposez la solution de travail d'anticorps secondaire dans la plaque de puits pour couvrir les cellules et incuber la température ambiante pendant 1 heure. Aspirer et jeter la solution de travail de l'anticorps secondaire et laver avec PBS 3 fois, 5 min à chaque fois. Notez que si vous utilisez un anticorps secondaire étiqueté fluorescente, vous devez éviter la lumière pendant l'incubation et le lavage;

12. Examen de couverture et microscopique:

S'il s'agit d'un anticorps secondaire marqué par HRP, utilisez le réactif chromogénique DAB (G1212 recommandé) pour développer la couleur de l'échantillon de cellules, de la déshydratation et de la transparence. Utilisez des pincettes pointées pour récupérer doucement la glissière et la monter à l'envers sur une glissière en verre propre. , Observation du microscope;

S'il s'agit d'un anticorps secondaire étiqueté fluoréscent, laissez tomber une monture de trempe anti-fluorescence (G1401 est recommandée) sur la glissière en verre propre, ramassez doucement la glissière avec des pincettes pointues, boucle à l'envers sur la glissière en verre et montez la glissière, observez-la avec un microscope à fluorescence;

Échantillons de section de tissus:

1. Préparation des animaux: Préparez des animaux expérimentaux à l'avance et effectuez l'étiquetage de BRDU in vivo, veuillez vous reporter à WGB8010. Après l'étiquetage in vivo, prenez des matériaux, fixez et préparez des sections de paraffine en fonction des besoins expérimentaux;

2. Les sections de paraffine tissulaires sont déparffinisées et réhydratées;

3. Réparation: regroupez la brosse pour encercler le tissu, plonger la tranche de la solution de récupération antigène et réparer en chauffant à micro-ondes. Refroidissement naturel

4. Coloration nucléaire (facultatif):

Pour la détection de lumière blanche ultérieure, assécher le noyau cellulaire avec hématoxyline: ajoutez une solution de coloration de l'hématoxyline à la plaque de puits pendant 5 min à la température ambiante, aspirez à la solution de coloration de l'hématoxyline et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 min;

Pour la détection ultérieure de la fluorescence, tacher le noyau cellulaire avec DAPI: ajoutez une solution de colorant DAPI à la plaque de puits pendant 5 min à la température ambiante, aspirez à la solution de colorant DAPI et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois;

5. RE-fixation: ajoutez 4% de paraformaldéhyde goutte à goutte au tissu et incubez pendant 10 min à la température ambiante, lavez 3 fois avec du PBS, 5 min à chaque fois;

6. Acidification: Ajoutez 1 m de HCl sur les tranches pour couvrir les tissus, traitez-les à 37 ° C pendant 10 min, lavez-les avec du PBS 3 fois, à 5 minutes à chaque fois;

7. Post-fixation: Ajoutez à nouveau 4% de paraformaldéhyde à nouveau à la plaque de puits et à incuber pendant 10 min, lavez-le avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

8. Trempelle de peroxydase endogène (en option): ajoutez 3% H2O2 goutte à goutte aux tranches et incubez à la température ambiante pendant 25 à 30 minutes pour éliminer la peroxydase endogène. Ensuite, les tranches ont été lavées 3 fois avec PBS, 5 min à chaque fois;

9. Blocage: Ajoutez une solution de blocage (3% BSA) sur les tranches pour couvrir le tissu et incuber à la température ambiante pendant 30 minutes. Retirez le fluide de blocage, ne nettoyez pas;

10. Incubation anticorps anti-BRDU: Ajouter une solution de travail anti-anticorps anti-BRDU aux tranches pour couvrir le tissu et incuber la nuit à 4 ° C. Supprimez la solution de travail anti-anticorps primaire anti-BRDU, lavez 3 fois avec PBS, 5 min à chaque fois;

11. Incubation d'anticorps secondaire: Ajoutez la solution de travail de l'anticorps secondaire à la section pour couvrir le tissu et incuber à la température ambiante pendant 1 heure. Retirez la solution de travail de l'anticorps secondaire, lavez 3 fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque fois. Notez que si vous utilisez un anticorps secondaire étiqueté fluorescente, vous devez éviter la lumière pendant l'incubation et le lavage;

12. Examen de couverture et microscopique:

S'il s'agit d'un anticorps secondaire marqué par HRP, utilisez le réactif chromogénique DAB (G1212 recommandé) pour développer la couleur de la section tissulaire, déshydrate, transparent et observer au microscope après montage;

S'il s'agit d'un anticorps secondaire étiqueté fluoréscent, ajoutez des comprimés de montage de trempe anti-fluorescence goutte à goutte (G1401 recommandé) pour monter et observer avec un microscope à fluorescence.

Observation des résultats

S'il est détecté avec un anticorps secondaire marqué par HRP, le noyau est bleu foncé et les cellules proliférant sont brunes. S'il s'agit d'un anticorps secondaire étiqueté fluorscente, le noyau affichera la fluorescence bleue (EX = 358 nm, em = 461 nm) et les cellules proliférant montrent la fluorescence de l'anticorps secondaire correspondant.

Remarques:

1. Pour les échantillons de glissière cellulaire, la concentration et le temps de traitement de BRDU sont liés aux types de cellules. De manière générale, la concentration et le temps requis pour traiter les cellules tumorales sont faibles. Les cellules avec une prolifération lente telle que des fibroblastes ou des cellules épithéliales doivent augmenter la concentration et prolonger le temps d'action. La plage de concentration recommandée est de 20 à 100 μm et le temps d'action est de 40 min. -4 heures, peut être ajustée en fonction des types de cellules spécifiques.

Le tableau suivant montre la concentration et le temps de traitement des cellules couramment utilisés, à titre de référence uniquement.

Cellule

Concentration BRDU (μm)

Temps d'incubation (min)

A549

40

40

Hela

40

40

Nrk-52e

40

40

Skov3

80

120

H9c2

40

40

2. Afin de garantir les meilleurs résultats expérimentaux, il est recommandé d'utiliser d'autres réactifs justificatifs produits par notre société: la teinture de l'hématoxyline (G1004); Tache Dapi (G1012); Kit de réactif de couleur DAB (G1212), comprimés de montage de trempe anti-fluorescence (G1401);

3. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des manteaux de laboratoire et des gants jetables pour fonctionner.

Le produit est à des fins de recherche scientifique uniquement, pas pour le diagnostic clinique!

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