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Kit de détection de l'apoptose de la cellule V-EGFP / PI d'annexe V-EGFP pour la cytométrie de flux ou la microscopie de fluorescence

Le volume: 50t

  • G1510-50T
  • Servicebio

Description du produit

Information produit:

Nom du produit

Chat. Non.

Le volume

Annexe V-EGFP / PI Cellule de détection de détection de l'apoptose cellulaire

G1510-50T

50t

G1510-100T

100t

Description du produit:

L'apoptose est un processus physiologique normal qui se produit dans le processus de développement embryonnaire et de maintenance des homéostases tissulaires. Il est accompagné de nombreux changements morphologiques. Parmi eux, la perte de la membrane cellulaire est l'une des premières caractéristiques de l'apoptose. Dans des cellules normales, la phosphotidylsérine (PS) n'est distribuée que sur le côté intérieur de la bicouche phospholipide de la membrane cellulaire. Cependant, au stade précoce de l'apoptose, PS se retournera du côté intérieur de la membrane lipidique au côté extérieur, l'exposant à l'extérieur de la cellule. ANNEXIN V (ANNEXIN V) est une protéine de liaison phospholipide CA2 + -Dépendante qui a une grande affinité pour PS et se lie spécifiquement aux cellules exposées à PS. Par conséquent, l'annexe V est utilisée comme l'un des indicateurs de détection de l'apoptose de la cellule précoce. L'iodure de propidium (PI) est un colorant d'acide nucléique. Il ne peut pas pénétrer des cellules normales avec des membranes cellulaires intactes et des cellules apoptotiques précoces, mais peut pénétrer les membranes cellulaires des cellules apoptotiques et nécrotiques tardives et tacher le noyau.

Ce produit utilise EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) et Annexine V pour former une protéine de fusion comme une sonde de détection pour détecter l'apoptose de la cellule précoce. Dans le même temps, PI est utilisé pour distinguer les cellules survivantes des cellules nécrotiques et des cellules apoptotiques tardifs. Lorsque l'annexe V-EGFP est utilisée en combinaison avec PI, les cellules vivantes présentent une coloration négative (annexine V- / PI-), les cellules apoptotiques précoes montrent que la fluorescence unique positive (annexe V + / PI-) et les cellules anticoptotiques tardives et cellules nécrotiques montrent dual Fluorescence positif (annexe V + / PI +). Ce kit convient à la cytométrie de flux ou à la détection de microscope à fluorescence. Dans le même temps, car EGFP et Annexin V sont fusionnés 1: 1, ce produit peut également détecter quantitativement les cellules apoptotiques.

Stockage et transport

Sac de glace (glace mouillée);

Ce kit est stocké à -20 ° C et présente une période de validité de 12 mois.

Composant:

Numéro de composant

Composant

G1510-50T

G1510-100T

G1510-1

Annexe V-EGFP

250 μL

2 × 250 μl

G1510-2

Iodure de propidium (PI)

250 μL

2 × 250 μl

G1510-3

1 × tampon de liaison

25ml

2 × 25 ml

Manuel de l'utilisateur du produit

1 pc

Étapes d'opération:

1. Cellules suspendues: Prenez la suspension cellulaire et ramassez les cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C;

Cellules adhérentes: Collectez d'abord le surnageant de la culture cellulaire. Après la digestion avec la trypsine sans EDTA (G4002 recommandée), se combinent avec le surnageant de la culture cellulaire et collectez les cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Le temps de digestion de la trypsine ne doit pas être trop long, afin d'éviter une digestion excessive et de causer de faux positifs.

2. Lavez les cellules deux fois avec du PBS pré-refroidi (G4202 recommandé) et collectez les cellules par centrifugation à 500 g à chaque fois pendant 5 min à 4 ° C;

3. remise en douceur des cellules dans le tampon de liaison pré-refroidi 1 × et ajuster la concentration de cellule à 1 ~ 5 × 106 / ml;

4. Prenez 100 μl de suspension cellulaire, ajoutez 5 μL annexine V-EGFP et 5 μL PI, mélangez doucement et protégez de la lumière à la température ambiante pendant 8 à 10 min;

5. Ajoutez 400 μl de tampon de liaison pré-fraisé 1 × partes, agitez doucement et effectuez la détection avec un cytomètre à flux ou un microscope à fluorescence dans un rayon de 1 h.

Analyse des résultats

1. Cytométrie de flux

une. Sélectionnez la tension appropriée et ajustez la compensation de la lumière pendant la détection et l'analyse de cytométrie de flux. Il est recommandé de définir une commande négative (non étiquetée avec l'annexe V-EGFP et PI) afin de régler la tension, à l'exception du groupe expérimental et d'une commande à une seule étiquette (ajouter uniquement des cellules d'annexine) V-EGFP et PI-Seul)) sont utilisés pour ajuster la compensation;

b. Exemples de référence de détection et d'analyse de cytométrie de flux:

Les cellules de lymphome T de Jurkat ont été induites avec une camptothecine de 5 μm pendant 6 heures. Reportez-vous à la procédure expérimentale ci-dessus et utilisez la cytométrie de flux pour détecter les résultats. Les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous.

La longueur d'onde d'excitation maximale de EGFP est de 488 nm et la longueur d'onde d'émission maximale est de 507 nm; La longueur d'onde d'excitation maximale du complexe PI-ADN est de 535 nm et la longueur d'onde d'émission maximale est de 615 nm. Le diagramme de points à deux dispersion a été tiré par le logiciel d'analyse correspondant du cytomètre de flux, avec EGFP sur l'Abscisse et PI sur l'ordonnée. Dans une expérience typique, les cellules vivantes n'ont pas de fluorescence et les points dispersés sont dans le premier quadrant de la gauche inférieure gauche. Les cellules apoptotiques au stade précoce ont une forte fluorescence verte et les points éparpillés sont situés dans le deuxième quadrant du niveau inférieur droit. Les cellules apoptotiques tardifs et les cellules nécrotiques montrent une double fluorescence rouge et verte, et les points diffusés sont situés dans le troisième quadrant du haut droit.

2. Inspection du microscope de fluorescence

Ajoutez 5-10 μL de suspension cellulaire à double coloration avec l'annexe V-EGFP et PI sur la glissière en verre, recouvrez-la avec un verre de couvercle et observe sous un microscope à fluorescence avec un filtre à deux couleurs. L'annexe V-EGFP montre un signal de fluorescence vert. PI a un signal fluorescent rouge.

Remarques:

1. Pendant toute l'expérience, l'opération devrait être aussi douce que possible pour éviter la casse des cellules et affecter les résultats expérimentaux.

2. Le lavage des cellules avec PBS ne peut pas être omis, et en même temps, retirez le PBS résiduel autant que possible.

3. Lorsque vous utilisez la trypsine pour digérer les cellules, vous devez veiller à éviter les dommages artificiels des cellules et à contrôler le temps de digestion. Si le temps de digestion est trop court, les cellules doivent être soufflées pour tomber, ce qui est susceptible de causer des dommages mécaniques à la membrane cellulaire; Si le temps de digestion est trop long, la membrane cellulaire est également vulnérable aux dommages. Affecter les résultats du test. De plus, la pancréatine contenant EDTA ne peut pas être utilisée. L'EDTA affectera la liaison de l'annexe V et du PS.

4. Une fois que les cellules adhérentes sont stimulées par l'apoptose, si certaines des cellules flottent, il est nécessaire de recueillir le surnageant de la culture cellulaire et des cellules adhérentes et de les tacher en même temps, ce qui rendra les résultats plus précis.

5. L'annexe V-EGFP et PI sont sensibles à la lumière, veuillez éviter la lumière pendant le fonctionnement. Le test doit être effectué dès que possible après la réaction.

6. Veuillez porter des vêtements de laboratoire et des gants jetables lors de l'expérience pour éviter la contamination et assurer la sécurité.

Ce produit est à des fins de recherche scientifique uniquement, pas pour le diagnostic clinique!

G1510-50TARéactif -1 (1)

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