TÉLÉPHONER

+86 (027) 5111 3188

catégorie de produit

Partager sur:

Kit de détection de l'apoptose de la cellule tunel (FITC) Cellule de tunel (FITC) utilisée pour la section de paraffine Section de tissu congelé Section de la cellule Cellule de la cellule

Le volume: 50t

  • G1501-50T
  • Servicebio
  • Servicebio

Description du produit

Information produit:

Nom du produit

Chat. Non.

Le volume

Kit de détection de l'apoptose de la cellule de tunelle de la fluorescéine (FITC)

G1501-50T

50t

G1501-100T

100t

Description du produit:

La rupture de l'ADN chromosomique dans l'apoptose est un processus progressif. L'ADN chromosomique est d'abord dégradé dans de grands fragments de 50 à 300 kb sous l'action des nucléases endogènes, puis environ 30% de l'ADN chromosomique est sous l'action des endonucléases CA2 + et MG2 + -Dépendants. Ils sont coupés au hasard pour former un polymère d'ADN nucléosomique de 180-200 pb. Par conséquent, à l'étape tardif de l'apoptose, l'ADN sera dégradé dans des fragments de 180 à 200 pb et un grand nombre d'extrémités 3'-OH seront exposées sur l'ADN génomique cassé. Le terminal désoxynucléotidyl transférase (TDT) est une ADN autonome indépendante de modèle qui peut catalyser la reliure de désoxynucléotides aux extrémités 3'-OH des molécules d'ADN cassées. Par conséquent, le kit de détection de la cellule d'apoptose cellulaire (TDT médiated Nick-end de Nick-end) peut être utilisé pour détecter la rupture d'ADN nucléaire de cellules de tissu au stade tardif de l'apoptose. Le principe est que, sous l'action de TDT Enzyme, la fluorescéine-étiquetée du SDP (FITC-12-DUTP) est incorporée à l'extrémité 3'-OH exposée lorsque l'ADN génomique est cassé, de sorte qu'il puisse être détecté avec un microscope à fluorescence ou un flux Cytomètre (excitation FITC 450-500 nm, émission 515-565 nm). Ce kit a une large gamme d'applications et convient à la détection de l'apoptose cellulaire dans des sections de tissu de paraffine, des sections de tissu congelées, des diapositives cellulaires, des frottis cellulaires, etc.

Stockage et transport

Sac de glace (glace mouillée);

Ce kit est stocké à -20 ° C. Le mélange d'étiquetage FITC-12-DUTP doit être stocké à -20 ° C dans le noir. La période de validité est de 12 mois.

Composant:

Numéro de composant

Composant

G1501-50T

G1501-100T

G1501-1

Enzyme recombinante TDT

50 μl

2 × 50 μl

G1501-2

Mélange d'étiquetage FITC-12-DUTP

250 μL

2 × 250 μl

G1501-3

Tampon d'équilibre

5 × 1 ml

10 × 1 ml

G1501-4

Proteinase K (200 μg / ml)

1 ml

2 × 1 ml

Manuel de l'utilisateur du produit

1 pc

Préparation avant expériment:

1. Le tampon de phosphate de PBS (G0002 ou G4202 est recommandé);

2. Solution de fixation: 4% de paraformaldéhyde dissous dans du PBS ou un autre système tampon, pH 7,4 (G1101 est recommandé);

3. Solution de rupture de la membrane: 0,1% Triton X-100 dissous dans 0,1% de citrate de sodium (G1204 est recommandé);

4. préparer des PBS contenant 0,2% de Triton X-100; Préparer des PBS contenant 0,1% TRITON X-100 et 5 mg / ml BSA;

5. Pour la coloration des noyaux, vous devez apporter votre propre DAPI (2 μg / ml) ou PI (1 μg / ml) (G1012, G1021, est recommandé);

6. Si vous avez besoin d'une expérience de contrôle positive, vous devez apporter votre propre DNase I (G3342 est recommandé)

7. Si vous utilisez un cytomètre de flux, préparez votre propre tache PI (G1021 recommandée) et RNase A (DNASE GRATUIT) (G3413 recommandé);

8. Veuillez porter des gants de laboratoire et des gants jetables pendant le fonctionnement.

Étapes d'opération:

I. Préparation des échantillons

A. Sections de tissus intégrées à la paraffine

1. Trempez la section tissulaire de la paraffine dans le xylène à la température ambiante pendant 5 à 10 minutes, répétez 2-3 fois; puis trempez-vous en éthanol absolu pendant 5 min, répétez deux fois; Enfin, utilisez de l'éthanol à gradient (85%, 75%, une double vapeur) de l'eau) tremper chaque fois une fois, à chaque fois pendant 5 min;

2. Rincer doucement la section avec du PBS et éliminer l'excès de liquide autour de l'échantillon; Utilisez un stylo histochimique pour dessiner un petit cercle d'une distance de 2 à 3 mm du tissu le long du contour extérieur du tissu afin de faciliter le traitement de la perméabilité en aval et les opérations de marquage de la balance; Pendant l'expérience, ne laissez pas l'échantillon sec et placez l'échantillon traité dans une boîte humide pour garder l'échantillon humide;

3. Préparer une solution de travail protéinase K: une protéinase diluée K (200 μg / ml) Solution de stock avec PBS comme diluant sur un rapport de 1: 9 pour faire la concentration finale de 20 μg / ml;

4. Ajoutez 100 μl de la solution de fonctionnement de la protéinase k susmentionnée à chaque échantillon afin de tout faire couvrir et d'incuber à 37 ° C pendant 20 min;

(Remarque: le traitement de la protéinase K est principalement utile pour la perméation des réactifs de coloration dans les étapes ultérieures des tissus et des cellules. Temps trop long ou peu d'incubation affectera l'efficacité d'étiquetage ultérieure. Afin d'obtenir de meilleurs résultats, le temps d'incubation de la protéinase K peut être optimisé)

5. Infiltrer et nettoyer l'échantillon avec la solution PBS 3 fois, 5 minutes à chaque fois (la protéinase K doit être lavée propre, sinon elle interférera avec la réaction d'étiquetage ultérieure) et placez l'échantillon traité dans une boîte humide pour garder l'échantillon humide;

6. (Étape facultative) Retirez l'excès de liquide sur l'échantillon, ajoutez une quantité appropriée de fluide de rupture (0,1% TRITON X-100 dans un citrate de sodium 0,1%) au tissu, complètement infiltrez le tissu et traitez-le à la température ambiante pour 20 minutes; Une fois le traitement de la rupture terminé, l'échantillon est rincé avec une solution PBS 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois; L'échantillon traité est placé dans une boîte humide pour maintenir l'échantillon humide.

B. Section congelée de tissu

1. Immergez les diapositives dans une solution de 4% de paraformaldéhyde (dissoute dans du PBS) pour la fixation et incuber pendant 10-15 min à la température ambiante;

2. Une fois le film sorti de la fixation, laissez-le sécher naturellement dans une hotte de fumée;

3. Rincer les diapositives dans de l'eau pure ou du PBS pour retirer la solution fixative restante sur les diapositives;

4. Utilisez un stylo histochimique pour dessiner un petit cercle de 2 à 3 mm à l'exception du tissu le long de la périphérie du tissu afin de faciliter les opérations de traitement de la perméabilité et de la balance de la perméabilité en aval; Pendant l'expérience, ne laissez pas l'échantillon sec et l'échantillon traité maintient l'échantillon humide dans une boîte humide;

5. Préparer la solution de fonctionnement de la protéinase K: une protéinase diluée K (200 μg / ml) Solution de stock avec PBS comme diluant sur un rapport de 1: 9 pour faire la concentration finale de 20 μg / ml;

6. Ajoutez 100 μl de la solution de fonctionnement de la protéinase k susmentionnée à goutte à chaque échantillon de sorte qu'il soit complètement recouvert et incube à la température ambiante pendant 10 min;

(Remarque: la protéinase k Traitement aide principalement les tissus et les cellules à imprirer les réactifs de coloration dans les étapes suivantes. Si le temps d'incubation est trop long ou trop court, cela affectera l'efficacité d'étiquetage ultérieure. Si aucun meilleur résultat n'est obtenu, l'incubation Le temps de protéinase k peut avoir besoin d'être optimisé)

7. Rincer l'échantillon 2-3 fois avec la solution PBS pour éliminer l'excès de liquide (la protéinase K doit être lavé propre, sinon elle interférera avec la réaction d'étiquetage ultérieure) et placez l'échantillon traité dans une boîte humide pour empêcher l'échantillon humide ;

8. (Étape facultative) Ajoutez une quantité appropriée de solution de rupture (0,1% TRITON X-100 dissous dans 0,1% de citrate de sodium) au tissu, infiltrez complètement le tissu et traitez-la à la température ambiante pendant 20 minutes. La même chose est vraie après la fin du traitement de la rupture. Rincer l'échantillon avec la solution PBS pour éliminer l'excès de liquide et placer l'échantillon traité dans une boîte humide pour maintenir l'échantillon humide.

Film d'escalade C.

1. Cultivez des cellules adhérentes sur les diapositives de la chambre Lab-Tek. Après le traitement d'induction de l'apoptose, rincez doucement les diapositives avec PBS;

2. Ajoutez une quantité appropriée de solution de paraformaldéhyde de 4% (dissoute dans du PBS) à chaque chambre à glissière pour la fixation et incuber pendant 20 min à la température ambiante;

3. Retirez le fixateur, ajoutez du PBS et lavez 3 fois, 5 min à chaque fois;

4. Chaque échantillon est immergé dans une solution de 0,2% de Triton X-100 préparée dans du PBS et incubé pendant 5 min à température ambiante pour la perméabilisation;

5. Immergez et nettoyez l'échantillon 2 à 3 fois dans un bécher ouvert rempli de solution PBS;

6. Retirez doucement l'excès de liquide et blotez délicatement le liquide autour de l'échantillon sur la glissière avec du papier filtre. L'échantillon traité est placé dans une boîte humide pour maintenir l'échantillon humide.

D. Frottis cellulaire

1. Resuspend des cellules dans du PBS à une concentration d'environ 2 × 107Cellules / ml, pipette 50-100 μL de suspension cellulaire sur la glissière en verre anti-goutte et utilisez une glissière de verre propre pour étaler doucement la suspension cellulaire;

2. Immergez les diapositives dans un pot de coloration contenant 4% de paraformaldéhyde fraîchement préparé au PBS, fixez les cellules et placez-les à 4 ° C pendant 25 min;

3. Plongez la glissière dans le PBS, laissez-la à la température ambiante pendant 5 minutes, puis répétez une fois;

4. Retirez doucement l'excès de liquide et blotez délicatement l'excès de liquide autour de l'échantillon sur la glissière avec du papier filtre. Utilisez un stylo histochimique pour dessiner un petit cercle le long de la périphérie de la cellule pour faciliter les opérations de traitement de la perméabilité en aval et de la balance de la balance. Pendant l'expérience, ne laissez pas l'échantillon à sec;

5. Chaque échantillon est immergé dans une solution de 0,2% de Triton X-100 préparée dans du PBS et incubé à la température ambiante pendant 5 minutes pour la perméabilisation;

6. Immergez et nettoyez l'échantillon 2 à 3 fois dans un bécher ouvert rempli de solution PBS;

6. Retirez doucement l'excès de liquide et utilisez du papier filtre pour absorber soigneusement le liquide autour de l'échantillon sur la diapositive. L'échantillon traité est placé dans une boîte humide pour maintenir l'échantillon humide.

II. Dnase I Traitement Expérience de contrôle positif (étape facultative)

Une fois que l'échantillon est perméabilisé, traitez l'échantillon avec DNase I (G3342 recommandé) pour préparer un contrôle positif.

1. Ajoutez 100 μl 1 × Dnase I tampon (Méthode de préparation: Prendre 10 μl 10 × Dnase I tampon, puis ajouter 90 μl d'eau désionisée pour mélanger) goutte à goutte sur l'échantillon imprégné et incuber à la température ambiante pendant 5 min;

2. Retirez doucement l'excès de liquide et ajoutez 100 μl de solution de travail contenant DNase I (20 U / ml) (Méthode de préparation: Prendre 10 μL 10 × Dnase I tampon, puis ajouter 2 μL Dnase I, puis ajouter 88 μl de mélange d'eau désionisée. ), incuber à la température ambiante pendant 10 min;

3. Retirez doucement l'excès de liquide et lavez les diapositives 3 à 4 fois dans un pot de coloration rempli de PBS.

(Remarque: un réservoir de coloration séparé doit être utilisé pour les diapositives de contrôle positifs, sinon la DNase Iase résiduelle I sur les lames de contrôle positifs peut introduire un fond élevé sur les diapositives expérimentales)

III. Marquage et test

1. Equilibration: Ajoutez un tampon d'équilibrage de 50 μL à chaque échantillon pour recouvrir la zone d'échantillonnage à tester et incuber à la température ambiante pendant 10 min;

2. Étiquetage Solution Préparation: Thaw FITC-12-DUTP Etiquetage Mélange et tampon d'équilibre sur la glace et suivez l'enzyme TDT recombinante: FITC-12-DUTP Mélange d'étiquetage: tampon d'équilibrage = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5: 50) Mélangez le tampon d'incubation TDT suffisant pour toutes les expériences. Le volume de réactifs utilisés dans des expériences spécifiques peut être ajusté dans une proportion appropriée en fonction de la taille de la diapositive;

3. Système de contrôle négatif: Préparez un tampon d'incubation TDT de contrôle sans enzyme de TDT recombinant et remplacez-le par DDH2O;

4. Étiquetage: essayez de retirer le tampon équilibré équilibré, puis ajoutez une tampon d'incubation de 56 μL à chaque échantillon de tissu et incubez à 37 ° C pendant 1 h; Soyez prudent de ne pas sécher les diapositives et les diapositives doivent être protégées de la lumière;

5. Rincer immédiatement l'échantillon de tissu avec du PBS pendant 4 fois, 5 min à chaque fois;

6. Essuyez doucement la solution PBS autour de l'échantillon avec du papier filtre;

7. Coloration nucléaire: L'échantillon est taché dans un réservoir de coloration et la diapositive est immergée dans un réservoir de coloration rempli de solution PI ou de solution DAPI (fraîchement préparé et dilué avec du PBS) dans le noir et laissé à la température ambiante pendant 8 minutes. ;

8. Montage de la diapositive: Après que l'échantillon soit coloré, lavez l'échantillon de tissu 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois, puis retirez doucement l'excès de liquide et ajoutez des comprimés de montage de trempe anti-fluorescence goutte à goutte (recommandé G1401) pour monter la diapositive. ;

9. Microscopie: analysez l'échantillon immédiatement sous un microscope à fluorescence et éloignez-vous les glissières de la lumière. Pi / Dapi peut tacher des cellules apoptotiques et non apoptotiques rouge / bleu, uniquement dans le noyau apoptotique FITC-12-DUTP incorporé et la fluorescence verte localisée.

Iv. Utilisez la cytométrie de flux pour détecter les cellules de suspension

1. Lavez les cellules à tester deux fois avec du PBS, centrifuge à 4 ° C (500 g) et de remise en suspension dans 500 μL PBS;

2. Fixation: Ajoutez 5 ml de solution de paraformaldéhyde de 1% préparée avec du PBS à l'échantillon, fixez les cellules et placez-la sur la glace pendant 20 minutes;

3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, retirez le surnageant et retirez-les deux fois dans 5 ml de PBS, puis remettez finalement les cellules dans 500 μL PBS;

4. Perméabilisation: ajoutez 5 ml d'éthanol à 70% pré-refroidis sur la glace à l'échantillon et incubez à -20 ° C pendant 4 heures pour imorber les cellules;

(Remarque: les cellules peuvent également être perméabilisées avec 0,2% de Triton X-100 dans la solution PBS à la température ambiante pendant 5 minutes)

5. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, les cellules ont été remises en suspension dans 5 ml de PBS et remises en suspension dans 1 ml de PBS après centrifugation;

6. Équilibration: Transférer environ 2 × 106 cellules sur un tube de microcentrifugeur de 1,5 ml, centrifuge à 300 g pendant 10 min, retirez le surnageant et remettez en suspension dans un tampon d'équilibrage de 80 μL et incubez à la température ambiante pendant 5 min;

7. PRÉPARATION DE SOLUTION D'ÉTIQUETAGE: THAW FITC-12-DUTP Etiquetage Mélange et tampon d'équilibre sur la glace et suivez la touche TDT recombinante: Mélange d'étiquetage FITC-12-DUTP: tampon d'équilibrage = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5 : 50) mélanger le tampon d'incubation TDT suffisant pour toutes les expériences et les réactions de contrôle positif facultatives;

8. Étiquetage: Les cellules ont été centrifugées à 300 g pendant 10 min, le surnageant a été retiré et la pellette a été remise en suspension dans 56 μL tampon d'incubation TDT et incubé à 37 ° C pendant 1 h, protégée de la lumière. Remettre doucement les cellules avec une micropipette toutes les 15 minutes;

9. Une fois la réaction terminée, ajoutez 1 ml d'EDTA de 20 mM pour arrêter la réaction et mélanger doucement avec une micropipette;

10. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min, retirez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 1 ml de solution de 0,1% de Triton X-100 préparé avec PBS, qui contient 5 mg / ml BSA et se laver deux fois;

11. Coloration nucléaire: Centrifuge à 300 g pendant 10 min, retirez le surnageant et remettez en suspension le culot de cellule dans une solution PI de 0,5 ml contenant 250 μg de rnase A. Incuber les cellules pendant 30 minutes à la température ambiante dans le noir;

12. Détection intégrée: analyse de cytométrie de flux des cellules, PI peut tacher des cellules apoptotiques et non apoptotiques en rouge, et uniquement dans le noyau des cellules apoptotiques, la FITC-12-DUTP incorporée et la fluorescence verte localisée.

G1501-50DDRéactif -1 (1)

Attention:

Ce produit est à des fins de recherche scientifique uniquement, pas pour le diagnostic clinique!


téléchargerSlice 10Slice 12Slice 13

Contact us

Liens rapides

catégorie de produit

Entrer en contact

 5ème étage, 22 bâtiment, Biopark, Gaoxin 2e route n ° 388, zone de développement de haute technologie de l'Est, Wuhan, Hubei, Chine 430079
 +86 (027) 5111 3188
Copyright © 2021 Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.