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PSWE-TOPO ZERO CLONING KIT DE CLONAGE POUR UN RÉACTE DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE MOLÉCULAIRE

Spécification: 25T
  • G3022-25T
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Description du produit

G3022-25T

Introduction:

Le kit de clonage zéro PSWE-topo produit par notre société est un vecteur de filtrage de recombinants positifs à travers l'expression de gènes de suicide et est modifié à partir du vecteur PUC19. Lorsque le fragment de gène cible n'est pas connecté au vecteur, le gène suicide est exprimé avec succès et correctement exprimé, et les cellules contenant le vecteur ne peuvent pas se développer; Lorsque le fragment de gènes cible est connecté avec succès au vecteur, le gène suicide ne sera pas exprimé correctement et les cellules contenant le vecteur peuvent se développer normalement. Ce vecteur est également appelé vecteur d'arrière-plan \"zéro \". Dans le même temps, le kit de clonage PSWE-topo zéro de notre société utilise une nouvelle méthode de ligature de vecteur, aucune ligase supplémentaire n'est nécessaire pour connecter le fragment au vecteur, seul le fragment de gène cible doit être ajouté au vecteur à la température ambiante (22 ℃ -37) L'opération de conversion peut être effectuée après avoir réagi pendant 5 minutes. Le kit de clonage Zero PSWE-TOPO est compatible avec le clonage TA clonage et le clonage d'extrémité émoussé.

Caractéristiques: Facile à utiliser, compatible avec le clonage TA et le clonage de bout émoussé; Aucune réaction d'enzyme supplémentaire n'est requise, le fragment de gène cible est ajouté au système et la transformation normale peut être effectuée à moins de 5 minutes à la température ambiante; Le taux positif peut atteindre 95%; fragments courts et longs applicables au clonage; Le marqueur de sélection est l'ampicilline; Premières de séquençage: amorce en avant M13, amorce inversée M13.

Stockage et transport

Transport avec glace humide; Stockage à -20 ° C, valable 12 mois.

Numéro de composant

Composant

G3022-25T

G3022-1

Pswe-topo zéro vecteur (50 ng / μl)

25 μL

G3022-2

Modèle de contrôle (700 BP, 50 ng / μl)

10 μL

G3022-3

M13 Première avant (10 μm)

50 μl

G3022-4

M13 Apprêt inversé (10 μm)

50 μl

Manuel

1

Pas

1. Préparation des produits PCR

(1) les amorces ne peuvent pas être phosphorylées; (2) La polymérase de haute fidélité et de la TAQ peut être utilisée pour les réactions de PCR; (3) Il est recommandé d'utiliser des kits de récupération de gel pour la purification de produits PCR après électrophorèse.

2. Système de réaction de référence:

Composant

Le volume

Pswe-topo zéro vecteur (50 ng / μl)

1 μL

Fragment de gènes

0,5-4 μL

Posologie recommandée de l'insert: le rapport molaire de vecteur au fragment = 1: 10-1: 3. Il peut être grossièrement calculé en ajoutant 50 ng de fragment de 1 Ko. Si la bibliothèque de gènes est construite, le système de réaction peut être expansé de manière appropriée.

3. Mélangez doucement les fragments de vecteur et de gène selon le système de réaction de référence ci-dessus, réagissez à la température ambiante (20-37 ° C) pendant 5 à 10 minutes et placez le tube centrifuge sur la glace.

4. Transformation: a. Ajoutez 50-100 μL clone compétent (ou ajoutez le produit de la réaction à 50-100 μL clone compétent), mélangez doucement et un bain de glace pendant 30 min; B, transformer immédiatement le choc thermique système à 42 ° C pendant 45 s, place immédiatement sur la glace pendant 2-3 min; c, ajoutez 200 μl de milieu SOC ou LB équilibré à la température ambiante dans le système de transformation et incuber à 200 tr / min et 37 ° C pendant 1 h; D, prendre 200 μL étaler la solution bactérienne sur une plaque résistante et l'inverser la nuit à 37 ° C (afin d'obtenir plus de clones, vous pouvez retirer une partie du surnageant après centrifugation et propager la solution bactérienne sur la plaque résistante).

5. Détection de transformants positifs:

une. Identification de la PCR de la colonie des clones positifs: choisissez un seul clone dans 10 μl d'eau stérile, Vortex à mélanger, puis prendre 1 μL du mélange sous forme de modèle PCR, et M13 Prompteur avant et amorce inverseur M13 comme des amorces universelles pour identifier des clones positifs par Colonie PCR. (Recommandez G3304 et G3305; reportez-vous au manuel de produit correspondant pour le système et les procédures de réaction PCR, et des fragments amplifiés par PCR de clones positifs> 100 BP)

b. Identification des clones positifs par digestion d'enzymes de restriction: choisissez un seul clone et l'inoculez-la dans une quantité appropriée de milieu liquide résistant et cultivez-la pendant une nuit à 220 tr / min et 37 ° C. Une petite quantité de plasmide a été extraite, digérée avec des enzymes de restriction appropriées et des clones positifs ont été identifiés par électrophorèse sur gel.

c. Séquençage Pour identifier des clones positifs: Utilisez l'apprêt avant M13 et les amorces d'amorce inversée M13 pour le séquençage et l'analyse.

Précautions

1. Lorsque vous utilisez le produit, il est conseillé de stocker le produit dans une boîte de glace ou sur un bain de glace et rangez-le à -20 ° C immédiatement après utilisation.

2. E. coli souches DB3.1, survie de la CCDB, stable, JM109, XL1-bleu et xl10-or, ces souches peuvent tolérer la CCDB et peuvent être utilisées pour propager ou stocker des plasmides contenant du CCDB, donc le vecteur zéro PSWE-topo est donc non applicable au filtre. Les cellules compétentes d'Escherichia coli qui ne sont pas tolérantes à la CCDB, telles que DH5α, Top10, TG1, couramment utilisées dans d'autres laboratoires, sont applicables.

3. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des manteaux de laboratoire et des gants jetables pour fonctionner.

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