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T4 ADN LIGASE 5 U / μL pour la connexion de l'ADN Réactif de biologie moléculaire

Spécification: 500U
  • G3340-100
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Description du produit

G3340-100

Introduction:

T4 DNA LIGASE peut catalyser la liaison de l'ADN à double brin ou à l'ARN à double échouement collant ou surmonté entre l'extrémité 5'-P et l'extrémité 3'-OH avec une liaison phosphodiester. Dans le même temps, l'enzyme peut également réparer des pseudiers à une seule brin dans des chaînes hybrides ADN à double échouement, ARN et ADN / ARN.

Définition de l'activité: une unité d'enzyme peut catalyser 1 NMOL de pyrophosphate étiqueté de 32p dans l'ATP à travers la réaction de déplacement dans les 20 minutes à 37 ° C (une unité est égale à environ 200 unités de fixation collante).

T4 ADN LIGASE Tampon de stockage:Tris-HCl de 20 mm (pH 7,5), 50 mm KCL, 1 mm DTT, 50% (v / v) glycérol.

5 × T4 DNA Tampon LIGASE:250 mm Tris-HCl (pH 7,6), 50 mm mgcl2, 5 mm ATP, 5 mm DTT, valorisation.

Stockage et transport

Transport avec glace humide; Stockage à -20 ° C, valable 12 mois.

Numéro de composant

Composant

G3340-50

G3340-100

G3340-1

T4 ADN LIGASE

250 U (50 μL)

500 u (100 μl)

G3340-2

5 × T4 DNA Tampon LIGASE

1 ml

2 × 1 ml

Manuel de l'Utilisateur

1

Conditions de réaction de la ligature

La réaction de ligature à 25 ° C pour les extrémités collantes prend 5-30 minutes; La réaction de ligature à 25 ° C pour les extrémités émoussées ne dépasse pas 2 heures ou la réaction à 4 ° C pendant la nuit.

Conversion de produits de ligature

1. Sortez des cellules compétentes (telles que E.Coli DH5α, E.Coli TOP10, etc.) du réfrigérateur -80 ℃ et placez-les sur la glace pour dégeler;

2. Ajoutez l'échantillon réagi à l'état compétent, déplacez doucement le fond du tube avec vos doigts pour mélanger et se baigner dans la glace pendant 30 minutes;

3. Placez ensuite le produit dans un bain d'eau de 42 ℃ sur le choc thermique pendant 90 s. Après sa fin, placez-le sur la glace rapidement pendant 2 à 5 minutes dans un bain de glace;

4. Prenez 900 μl de support soc ou lb stérile et ajoutez-le au tube EP. Après mélange, placez le tube EP sur un agitateur et incubez-le à 220 tr / min à 37 ° C pendant 1 heure pour réanimer les bactéries (il peut également être placé dans un incubateur de 37 ° C. Placez la culture pendant 1 heure);

5. Selon les exigences expérimentales, dessinez différents volumes de cellules compétentes transformées et ajoutez-les au milieu solide LB contenant les antibiotiques correspondants, étalez les cellules uniformément et, après que le liquide est complètement absorbé, placez la plaque à l'envers dans les 37 ° C incubateur et cultiver la nuit.

Identification des clones positifs

Les colonies monoclonales cultivées sur la plaque sont cueillies pour l'identification de la PCR de colonie ou après la culture, le plasmide est extraite par la digestion de restriction ou l'identification de la PCR, ou le plasmide extrait est directement séquencé et analysé pour l'identification.

Précautions

1. Il est recommandé de configurer le système de réaction sur la glace.

2. Lorsque la concentration du vecteur et du fragment cible est faible, il n'est pas nécessaire d'ajouter de l'eau et d'utiliser directement pour maquillage.

3. Il est recommandé que le rapport molaire de l'ADN vectoriel sur un fragment d'ADN inséré est de 1: 3 ~ 1: 10.

4. Une petite quantité de précipitations dans le tampon LIGASE DNA 5 × T4 est normale. Il peut être dissous à 37 ° C avant l'expérience et il sera utilisé après le mélange à fond. Cela n'a aucun effet sur l'expérience; Il est recommandé de se dissoudre dans des aliquotes et de geler.

5. L'ADN T4 LIGASE est recommandé de sortir lorsqu'il est utilisé et remis à -20 immédiatement après utilisation.

6. Lorsque l'électroporation est utilisée pour la transformation, le produit de la ligature doit être purifié par méthode de colonne ou méthode de précipitation à l'éthanol.

7. Lors de la connexion du vecteur surmonté du fragment d'ADN, le vecteur doit être déphosphorylé (G3400 est recommandé) pour empêcher sa circularisation de soi.

8. Veuillez porter des gants de laboratoire et des gants jetables pendant le fonctionnement.

G3340-1004G3340-100O

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