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Tsaplus fluorescence triple kit de coloration Tyramide amplification de signal Amplification de l'immunofluorescence Réactif

Spécification: 50T
  • G1236-50t
  • Servicebio

Description du produit

Kit de coloration triple TSAPLUS Fluorescence

CAT N ° G1236-50T

Contenu du colis:

Numéro d'article du produit

Nom du produit

spécification

Kit de coloration triple TSAPLUS Fluorescence

G1236-50t

50t

G1236-100T

100t

Présentation du produit:

Ce produit Tsaplus Fluorescent Triple Kit de coloration convient à l'immunofluorescence de multiples sections de paraffine, en particulier pour une immunolabélisation fluorescente multiples d'anticorps primaires provenant de la même source, ainsi que de multiples immunolabélements fluorescents d'anticorps de différentes sources. Le principe principal est basé sur l'amplification du signal Tyramide (TSA, l'amplification du signal Tyramide), ci-après dénommée la technologie TSA. Le principe principal de la technologie TSA est d'utiliser la réaction de la peroxydase du tyramide (c'est-à-dire que le sel de tyramide étiqueté fluorscente constitue un site de liaison de liaison covalent sous HRP catalysé par H2O2) pour produire un grand nombre de réactions enzymatiques. Ce produit peut interagir avec les résidus de protéines environnants (y compris les résidus de tryptophane, d'histidine et de tyrosine) se combiner pour former une grande quantité de dépôt de fluorescéine au site de liaison antigène-anticorps pour obtenir une amplification du signal. Ce kit utilise des colorants fluorescents 488/555/647 pour étiqueter la tyramine. La tyramine fluorescente résultante a une forte fluorescence et un signal stable, qui peuvent être utilisés pour une multiplexaction répétée multiple pour atteindre de multiples taches fluorescentes.

Les données de spectre de fluorescence des colorants fluorescents pertinents des kits de coloration fluorescents de la série TSA sont les suivants:

Type de colorant fluorescent

Ex / em

Fitc-tyramide

492/518

Cy3-Tyramide

555/569

if488-tyamide

491/516

Si555-Tyramide

557/570

IF647-Tyramide

656/670

Conditions de stockage:

Les packs de glace transport, le magasin à -20 ° C, la période valide est de 12 mois.

Composition

Numéro de composant

Composant

G1236-50t

G1236-100T

Stockage

G1236-1

if488-tyamide

25 μL

2 × 25 μl

-20

G1236-2

Si555-Tyramide

25 μL

2 × 25 μl

-20

G1236-3

IF647-Tyramide

25 μL

2 × 25 μl

-20

G1236-4

Tyramide Diluant

50 ml

50 ml

4

G1236-5

Dapi (prêt à l'emploi)

10 ml

20 ml

4

G1236-6

Tissu Autofluorescence Autorcher une solution

10 ml

20 ml

Température ambiante

G1236-7

Tissue Autofluorescence Tanther B Solution B

10 ml

20 ml

Température ambiante

G1236-8

Éruption anti-fluorescence

5 ml

10 ml

-20

Préparation avant expériment:

1. Préparez une tampon PBS de 0,01 mol / L (PH7.0-7.4, recommandé G4202 ou G0002), 3% H2O2 et 0,3% H2O2;

2. Préparer un anticorps principal et un anticorps secondaire étiqueté par le HRP correspondant, une solution de récupération d'antigène (choisissez la solution de récupération d'antigène appropriée en fonction du type d'anticorps et de tissus);

3. Selon la posologie, préparez une solution de travail de teinture TSA en fonction du ratio suivant.

Solution de travail de coloration TSA

Article de réactif

Le volume

Solution de coloration TSA-488

Tyramide Diluant

1 ml

0,3% H2O2

10 μL

if488-tyamide

2 μL

Solution de coloration TSA-555

Tyramide Diluant

1 ml

0,3% H2O2

10 μL

Si555-Tyramide

2 μL

Solution de coloration TSA-647

Tyramide Diluant

1 ml

0,3% H2O2

10 μL

IF647-Tyramide

2 μL

Remarque: une fois que le tyramide fluorescent est fondu, centrifuger pendant une courte période, puis le prenez après avoir mélangé avec des astuces de pipette propre. La solution de coloration TSA est recommandée pour être préparée à une utilisation immédiate. Il devrait être stocké à 4 ° C et protégé de la lumière, et il est efficace dans les 24 heures.

Pas

Prendre des diapositives de tissu à titre d'exemple, l'eau dans les étapes expérimentales suivantes est de l'eau pure.

1. déparaffiniser des sections de tissu à l'eau;

2. Récupération de l'antigène: Selon l'anticorps principal utilisé et le type d'échantillon, utilisez une méthode appropriée pour effectuer une récupération de l'antigène sur la section tissulaire.

3. Lavez 3 fois avec PBS, 5 min à chaque fois, utilisez un stylo papeux pour encercler et marquer le tissu;

4. Ajoutez 100 μl d'autofluorescence de tissu désordre une solution goutte à goutte au tissu, incuber à la température ambiante pendant 30 minutes et lavez-vous pendant 5 min;

5. Inactivez la peroxydase endogène: ajoutez 3% H2O2 à la section pour couvrir le tissu et incuber dans l'obscurité à la température ambiante pendant 25 minutes, pour bloquer la peroxydase endogène pour réduire la coloration des arrière-plan non spécifique. Laver 3 fois avec 1 × PBS, 5 min à chaque fois;

6. Bloc: Une fois les diapositives légèrement séchées, 3% BSA ou sérum sont ajoutés goutte à goutte pour sceller pendant 30 minutes. Le réactif de blocage est déterminé en fonction de l'espèce de l'anticorps primaire et de l'anticorps secondaire;

7. Incuber l'anticorps principal: diluer l'anticorps principal à une concentration appropriée avec une solution de PBS ou une solution de blocage 1 × (G2010 est recommandée). Sacez doucement la solution de blocage sur la section, ajoutez l'anticorps primaire dilué goutte à goutte pour recouvrir le tissu et placez la section à plat dans une boîte de chambre humide avec de l'eau et incubez toute la nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec 1 × PBS, 5 min à chaque fois;

8. Incuber l'anticorps secondaire marqué par HRP: Diluer l'anticorps secondaire à une concentration appropriée avec une solution de PBS ou une solution de blocage 1 × (G2010 est recommandée), ajoutez l'anticorps secondaire goutte à goutte au tissu et incubez à la température ambiante pendant 50 min. Laver 3 fois avec 1 × PBS, 5 min à chaque fois;

9. Ajoutez 50-100 μL TSA-488 Solution de travail de coloration au tissu afin de vous assurer que le tissu est complètement recouvert et incube pendant 10 min à température ambiante dans le noir. Laver avec 1 × PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

10. Traitement à micro-ondes: la section de tissu est placée dans une boîte de réparation remplie de solution de récupération d'antigène (choisissez la solution de récupération d'antigène appropriée en fonction du type de tissu et de l'anticorps) pour un traitement de chauffage à micro-ondes pour éliminer les anticorps primaires et secondaires liés. Dans cette étape, il est nécessaire d'empêcher des flocons secs causés par une évaporation liquide excessive.

11. Répétez l'étape 7 pour incuber le deuxième anticorps principal: Diluer le deuxième anticorps (anticorps primaire) à tester avec PBS (ou autre diluant d'anticorps) à une concentration appropriée. Sacez doucement le liquide sur la section, ajoutez l'anticorps dilué goutte à goutte pour recouvrir le tissu et placez la section à plat dans une boîte humidifiée avec de l'eau et incubez toute la nuit à 4 ° C. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

12. Répétez l'étape 8 pour incuber l'anticorps secondaire du HRP correspondant: diluer l'anticorps secondaire à une concentration appropriée avec PBS (ou autre diluant d'anticorps), ajoutez l'anticorps secondaire goutte à goutte au tissu et incubez à la température ambiante pendant 50 min. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

13. Ajoutez une solution de travail de coloration de 50 à 100 μl TSA-555 au tissu afin de vous assurer que le tissu est complètement recouvert et incube pendant 10 minutes à la température ambiante dans le noir. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

14. Traitement des micro-ondes: la section de tissu est placée dans une boîte de réparation remplie de solution de récupération d'antigène (choisissez la solution de récupération d'antigène appropriée en fonction du type de tissu et de l'anticorps) pour le traitement du chauffage à micro-ondes pour éliminer les anticorps primaires et secondaires liés. Dans cette étape, il est nécessaire d'empêcher des flocons secs causés par une évaporation liquide excessive.

15. Répétez l'étape 7 pour incuber le deuxième anticorps principal: Diluer le deuxième anticorps (anticorps primaire) à tester avec du PBS (ou un autre diluant d'anticorps) à une concentration appropriée. Sacez doucement le liquide sur la section, ajoutez l'anticorps dilué goutte à goutte pour recouvrir le tissu et placez la section à plat dans une boîte humidifiée avec de l'eau et incubez toute la nuit à 4 ° C. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

16. Répétez l'étape 8 pour incuber l'anticorps secondaire du HRP correspondant: diluer l'anticorps secondaire à une concentration appropriée avec PBS (ou autre diluant d'anticorps), ajoutez l'anticorps secondaire goutte à goutte au tissu et incubez à la température ambiante pendant 50 min. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

17. Ajoutez 50-100 μL TSA-647 Solution de travail de coloration au tissu afin de garantir que le tissu est complètement recouvert et incube pendant 10 minutes à la température ambiante dans le noir. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois;

18. NUCLEUS CONTAGNANT AVEC DAPI: Une fois que les sections sont légèrement séchées, ajoutez une solution de coloration DAPI au tissu et incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans le noir. Laver avec du PBS 3 fois, 5 min à chaque fois.

19. Domket d'autofluorescence tissulaire: Ajoutez la solution de désordre Autofluorescence de tissu B goutte à goutte au tissu, incuber à la température ambiante pendant 5 min et rincer à l'eau courante pendant 3 min;

20. Examen de montage et microscopique: Une fois les sections séchées légèrement, ajoutez un érupteur anti-fluorescence pour monter les diapositives. Observez et collectez des images avec un microscope à fluorescence ou un microscope laser confocal. Les tranches peuvent être stockées pendant 15 jours à 4 ° C dans une boîte à glissière anti-lumière.

Précautions

1. Par rapport à l'anticorps secondaire fluorescent, le kit TSA a une sensibilité plus élevée et un signal plus fort. Par conséquent, la concentration de l'anticorps principal doit être réduite, généralement de 5 à 10 fois sur la base du rapport de dilution recommandé dans le manuel d'anticorps, afin de réduire la fluorescence de fond causée par une liaison non spécifique. Il est recommandé de définir la concentration de gradient de l'anticorps primaire pour obtenir le meilleur effet.

2. Si la fluorescence de fond est forte, il est recommandé d'ajouter une étape de trempe d'autofluorescence tissulaire.

3. Le rapport de dilution recommandé du tyramide fluorescent est de 1: 500 et le rapport de dilution peut être ajusté en fonction des résultats expérimentaux (la plage de ratio de dilution recommandée est de 1: 200-1: 1000).

4. Pour un étiquetage fluorescent multiple, il est recommandé d'incuber l'anticorps polyclonal en premier, puis incubez l'anticorps monoclonal; Incuber l'anticorps correspondant à la protéine cible à faible abondance, puis à incuber l'anticorps correspondant à la protéine cible à grande abondance.

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